500年來，人們一直對《蒙娜麗莎》神秘的微笑莫衷一是。不同的觀者或在不同的時間去看，感受似乎都不同。有時覺得她笑得舒暢溫柔，有時又顯得嚴肅，有時像是略含哀傷，有時甚至顯出譏嘲和揶揄。在一幅畫中，光線的變化不能像在雕塑中產生那樣大的差別。但在蒙娜麗莎的臉上，微暗的陰影時隱時現，為她的雙眼與唇部披上了一層面紗。而人的笑容主要表現在眼角和嘴角上，達·芬奇卻偏把這些部位畫得若隱若現，沒有明確的界線，因此才會有這令人捉摸不定的“神秘的微笑”。荷蘭阿姆斯特丹的一所大學應用“情感識別軟件”分析出蒙娜麗莎的微笑包含的內容及比例：高興83%，厭惡9%，恐懼6%，憤怒2%。

　　哈佛大學神經科專家瑪格麗特·利文斯通博士說，蒙娜麗莎的微笑時隱時現，是與人體視覺系統有關，而不是因為畫中人表情神秘莫測。利文斯通博士是視覺神經活動方面的權威，主要研究眼睛與大腦對不同對比和光暗的反應。利文斯通說：“笑容忽隱忽現，是由于觀看者改變了眼睛位置。”她表示，人類的眼睛內有兩個不同部分接收影像。中央部分(即視網膜上的淺窩)負責分辨顏色、細致印記。環繞淺窩的外圍部分則留意黑白、動作和陰影。據利文斯通說，當人們看著一張臉時，眼睛多數集中注視對方的雙眼。假如人們的中央視覺放在蒙娜麗莎的雙眼，較不準確的外圍視覺便會落在她的嘴巴上。由于外圍視覺并不注重細微之處，無形中突出了顴骨部位的陰影。如此一來，笑容的弧度便顯得更加大了。不過，當眼睛直視蒙娜麗莎的嘴巴，中央視覺便不會看到陰影。利文斯通說：“如果看著她的嘴巴，便永遠無法捕捉她的笑容。”蒙娜麗莎的笑容若隱若現，源于人們的目光不斷轉移。利文斯通指出，若要臨摹《蒙娜麗莎》，描繪口部時便要望著別處。

　　1993年，加拿大美術史家蘇珊·吉魯公布了一項令人震驚的研究成果。她說蒙娜麗莎那傾倒無數觀賞者的口唇，是一個男子裸露的脊背。這一論斷既新鮮又荒誕，然而論證是有力的。集畫家、雕刻家、建筑師、工程師及科學家等多種才藝于一身的達·芬奇，可謂是個“怪杰”。他喜歡穿粉紅色外套，在胡須上毫無顧忌地涂上五顏六色，還常稱自己解剖過不下30具死尸。他還是個左撇子，習慣從右到左倒著書寫，別人要借助鏡子才能讀出他寫的東西。因此借助鏡子亦不失為欣賞者讀畫的一種方法。旋轉90度后從鏡中看蒙娜麗莎抿著的笑唇，恰好是一個背部線條分明的結實男性脊背以及左臂和肘部的一角；再說，表現人體美和呼喚人性的覺醒，既是大師的人生哲學，又是他的藝術觀。

　　確實，在不同角度不同光線下欣賞這幅畫，人們都會得到不同的感受。那微笑時而溫文爾雅，時而安詳嚴肅，時而略帶哀傷，時而又有幾分諷嘲與揶揄，神秘莫測的微笑顯露出人物神秘莫測的心靈活動。

　　幾百年來，“微笑”的新解層出不窮。諸如微笑不露皓齒是因原型雖典雅美麗卻口齒不齊；原 專家揭秘蒙娜麗莎隱藏四種動物型因愛女夭折，憂郁寡歡，難掩凄楚之態；更有甚者，把蒙娜麗莎從貴婦寶座上推落下來，把原型貶為妓女，故而微笑中帶著譏嘲和揶揄。

　　美國馬里蘭州的約瑟夫·鮑考夫斯基博士認為：“蒙娜麗莎壓根就沒笑，她的面部表情很典型地說明她想掩飾自己沒長門牙。”

　　法國里昂的腦外科專家讓·雅克·孔代特博士認為蒙娜麗莎剛得過一次中風，請看，她半個臉的肌肉是松弛的，臉歪著所以才顯得微笑。

　　英國醫生肯尼思·基友博士相信蒙娜麗莎懷孕了。他的根據是：她的臉上流露出滿意的表情，皮膚鮮嫩，雙手交叉著放在腹部。性學專家推測：蒙娜麗莎剛剛經歷了性高潮，所以才表現出令世人傾倒的微笑。